分秒必争，赛默飞orbitrap质谱参与全球xin冠抗疫研究
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赛默飞世尔，作为全球抗疫先锋之一，在背后助力全球科学家的研究，守护我们的健康 ，让世界更安全。
由sars-cov-2（2型严重急性呼吸综合征冠状病毒）引起的新型冠状病毒肺炎（covid-2019）具有高传染性，新型冠状病毒肺炎在中国和国际的迅速传播引发了全球卫生紧急情况。全球ding尖的科学家针对xin冠病毒进行争分夺秒的研究，利用orbitrap质谱技术参与分析病毒相关蛋白结构，病毒感染机制等内容，本文将讨论orbitrap高分辨质谱在xin冠病毒感染致病等机制的全球亮点研究及技术进展。
1. 靶向蛋白定量方法监测xin冠病毒蛋白动态变化
orbitrap eclipse高灵敏度平行反应监测靶向定量xin冠病毒蛋白
2019年美国质谱年会，赛默飞重磅推出三合一系列的创新巅峰之作——thermo scientifictm orbitrap eclipsetm 质谱仪，旨在解决生物学研究中的分析难题，轻松应对蛋白质组学，生物制药与蛋白质高级结构分析研究中的各项挑战，推出不久即投入到xin冠病毒研究中。
最近，荷兰鹿特丹伊拉斯马斯大学研究团队使用 orbitrap eclipse检测sars-cov-2病毒蛋白肽段序列，作为潜在的诊断工具。作者利用easy1200液相和eclipse质谱使用靶向方法-平行反应监测（prm）追踪病毒感染vero细胞后，几种sars-cov-2蛋白的肽段变化。作者研究了sars-cov-2蛋白prm实验的检测限，主要是核衣壳蛋白（ncap），这是zui丰富的病毒蛋白，因此是比较好的候选测试分子。orbitrap eclipse 质谱的prm结果显示对该蛋白灵敏度可达到amol级别，大约为0.9pg。粗略计算表明，这种灵敏度水平应足以检测理论上与约10000个sars-cov-2颗粒相对应的蛋白量。且其他sars-cov-2蛋白也是prm靶向方法的良好候选蛋白[1]。
图. orbitrap eclipse靶向prm监测sars-cov-2病毒蛋白肽段序列
此外作者还在进行了整体蛋白质组学分析。在60-90分钟分析时间内，共鉴定出6500种相关蛋白质。这表明蛋白质组学可以用来研究病毒感染宿主细胞的蛋白质组，是未来新兴的研究工具。
2. 蛋白质组学研究xin冠病毒感染的调控机制研究
2.1 orbitrap 高分辨质谱研究病毒宿主相互作用蛋白揭示感染机制
sars-cov-2病毒的基因组有29811个核苷酸，可编码28-29个蛋白质。其中一个蛋白质e 是一种包膜蛋白，是有助于形成病毒油泡的结构蛋白。一旦病毒进入细胞，它还有其他的功能。例如，附着在蛋白质上，有助于打开和关闭我们自己的基因。当e蛋白干扰时，模式可能会改变。vistara bioscience研究人员最近进行一项研究发现，蛋白质e与寄主细胞中的溴多胺蛋白结合。bromodomain 4（brd4）是bet亚家族蛋白，通过识别乙酰化组蛋白提供了一个招募平台作用，与非组蛋白靶点相关，除与病毒蛋白复合外，还参与nfkb信号转导、myc调控。此外，brd4还与其它bromodomain蛋白存在协同作用，其中一些还可能执行泛素化功能。另有一位作者使用qe hfx质谱描述了brd4相互作用蛋白的分子表型，使用了经bet抑制剂、与brd4结合的化合物以及可能的其他bromodomain蛋白处理的人类b细胞系蛋白质组。结果发现，已鉴定的蛋白定位于sars-cov-2病毒感染细胞的相互作用重编程途径和复合物中[2]，如下图所示。
图. 蛋白组学分析sars-cov-2病毒感染细胞后brd4相关互作蛋白
2.2. q exactive hf质谱非标定量技术监控病毒感染细胞实时变化
法国巴黎萨克利大学团队，通过使用thermo scientifictm orbitrap q exactive hftm质谱进行niao枪法蛋白质组学研究，获得了 sars-cov-2感染的相关信息，确定了病毒颗粒抗原产生的zui佳条件。技术流程如下图所示。
作者用sars-cov-2感染vero e6细胞（moi 0.01和0.001）。然后用lfq（非标记定量方法）方法在几天内监测感染的实时变化。总共鉴定了3220个vero细胞蛋白和6个sars-cov-2蛋白，以及27388个vero细胞和94个病毒特异肽段（fdr<1%）。病毒蛋白水平在不同时间点的动态变化表明，sars-cov-2蛋白合成在感染后持续增加，在感染第3天左右达到最大值。为了评估质谱获得的病毒图谱在多大程度上反映了病毒的产生，作者通过qpcr在同一时间点测量了sars-cov-2 rna分子，观察到了极为丰富的病毒蛋白产量的变化[3]，从而证实可以使用基于质谱的lfq非标定量法监测sars-cov-2的感染动力学。
图. q exactive hf质谱进行niao枪法蛋白质组学研究sars-cov-2感染的相关蛋白
3. orbitrap高分辨质谱针对xin冠病毒糖蛋白结构研究进展
3.1. orbitrap fusion质谱结合冷冻电镜解析sars-cov-2 s糖蛋白多糖结构
来自ccrc的robert woods实验室通过大量实验生成了 sars-cov-2 s糖蛋白上的聚糖三维结构。整个研究基于所报道的s蛋白3d结构和相关的糖组学数据[4]，由赛默飞冷冻电镜cryo_em 以及thermo scientifictm orbitrap fusiontm 质谱结合分析。
他们进行了分子动力学模拟，以观察多糖的微观异质性对表位暴露的影响。模糊位置为聚糖结构。m9型（绿色），m5型（深黄色），混合型（橙色），复合型（粉色）。
图. sars-cov-2 s糖蛋白聚糖结构和多糖微观异质性
3.2. orbitrap fusion lumos质谱绘制xin冠病毒sars-cov-2 s蛋白糖基化图谱
新型冠状病毒（sars-cov-2）中的刺突蛋白（spike蛋白）是一种高度糖基化的蛋白质，是病毒结合和进入宿主细胞的关键调节因子，也是研发抗体及相关药物的关键靶点。该蛋白的位点特异性n-糖基化修饰（包含糖基化位点和糖链信息）分析对于了解其功能和药物研发具有重要意义。四川大学华西医院科研团队针对该蛋白的位点特异性n-糖基化修饰进行深入分析[5]，具体实验流程如下。
图. 利用orbitrap质谱分析xin冠病毒s蛋白n-糖基化流程
通过使用thermo scientifictm orbitrap fusiontm lumostm质谱技术的整合糖蛋白质组学新方法，绘制了xin冠病毒sars-cov-2重组表达蛋白的所有n糖基化修饰位点以及位点特异性的n-糖链组成图谱，如下图所示。
图. s糖蛋白位点特异性n糖基化位点修饰谱
4. 蛋白质组结合代谢组研究xin冠病毒感染病人血清生物标志物
多组学方法研究xin冠肺炎轻重症患者血清中蛋白和代谢生物标志物
西湖大学生命科学学院与合作团队对xin冠肺炎患者血液中的蛋白质和代谢物分子进行系统检测，利用多组学方法研究重症患者血清的多种蛋白和代谢物分子表型，寻找潜在生物标志物，有望为预测轻症患者向重症发展提供导向。
实验对99例病毒灭活处理的血清样本进行了安全处理和orbitrap质谱分析。根据现行临床诊断标准，样本被分为对照（健康）组、普通流感组、xin冠感染轻症组、xin冠感染重症组。运用qe hf质谱对血清样本中的蛋白质和代谢物的相对浓度进行整体分析[6]，揭示重症患者体内多种分子调控，具体流程如下图所示。
图. 蛋白质组学结合代谢组学围绕xin冠肺炎患者队列进行分析流程
与对照（健康）组、普通流感组和轻症组相比，xin冠肺炎重症患者的样本中出现了93种特有的蛋白表达和204个特征性改变的代谢分子。其中50种蛋白，与患者体内的巨噬细胞、补体系统、血小板脱颗粒有关。研究团队还发现，在xin冠病毒感染的重症患者体内，有100多种氨基酸及100多种脂质均显著减少。见下图。
图. covid-2019感染后重症患者体内的巨噬细胞等通路蛋白质和代谢物变化
基于orbitrap质谱技术和机器学习分析方法，短时间内整合蛋白质组、临床、生物、代谢组、计算等多学科数据筛选出重症患者特征性的22个蛋白质和7个代谢物，有望可以辅助现有的诊断分析手段，实现更精准、高效的治疗。
新型冠状病毒肺炎疫情来势汹汹，牵动着每一个人的心，在这没有硝烟的抗疫战场上，白衣天使和医学研究者都是勇敢的战士。赛默飞也在以自己的力量全力支持国内的xin冠病毒科学研究，我们整理了基于orbitrap超高分辨质谱技术在xin冠病毒相关的全球亮点研究，谨以此文致敬白衣天使和深耕医学研究的学者们，默默付出，勇敢向前。
参考文献
[1] targeted proteomics for the detection of sars-cov-2 proteins, wangzhi:biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.23.057810v1
[2] a proteomic model of sars-cov2 infection by comparing the interactomes of brd4 with bet-inhibition and sars-cov2 viral proteins – implications for re-purposing approved drugs or ubiquitin-mediated degradation of select candidates，doi:10.21203/rs.3.rs-24573/v1
[3] shotgun proteomics of sars-cov-2 infected cells and its application to the optimisation of whole viral particle antigen production for vaccines, wangzhi:.biorxiv.org/content/10.1101/2020.04.17.046193v1
[4] 3d models of glycosylated sars-cov-2 spike protein suggest challenges and opportunities for vaccine development, doi: wangzhi:doi.org/10.1101/2020.04.07.030445
[5] site-specific n-glycosylation characterization of recombinant sars-cov-2 spike proteins using high-resolution mass spectrometry, wangzhi:doi.org/10.1101/2020.03.28.013276.
[6] proteomic and metabolomic characterization of covid-2019 patient sera, wangzhi:medrxiv.org/content/10.1101/2020.04.07.20054585v1
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